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【色谱知识分享】HPLC常见问题讨论
发布时间：
2024-09-06
HPLC常见问题
分析与讨论
我们在进行高效液相色谱实验时常常会遇见各种峰型问题，例如峰拖尾、峰展宽等，除此之外还有保留异常与基线异常，影响实验的定量甚至定性。
为了更好解决以上问题，掌握色谱技术，本篇推文将从高效液相色谱常见峰型异常、保留异常与基线异常三个方面进行讨论。
1 峰型异常
实验中常见的异常峰型有目标峰前后有小峰、拖尾峰/峰展宽、前沿峰、负峰、肩峰(双峰)、鬼峰等情况。
1.1 目标峰前后有小峰
（1）样品不纯——可以通过调整色谱条件或者更换色谱柱解决；
（2）分析柱/保护柱的柱头塌陷——该情况较为常见，此时往往所有的峰都分裂，可以清洗或者再生色谱柱；
（3）柱容量下降——色谱柱使用较长时间后，一些强保留的组分会吸附在柱内，可采用强洗脱溶剂清洗色谱柱，或者更换色谱柱；
（4）溶剂效应——样品溶剂与流动相洗脱能力相差大，可更换样品溶剂；
（5）样品分解
1.2 拖尾峰
（1）色谱柱塌陷——更换柱子
（2）pH不合适——碱性化合物可在流动相里添加1%左右的三乙胺，再用磷酸调回酸性**。
（3）管路没接好——液相色谱管线的差异也会导致峰型变化，管线死体积大会导致峰拖尾，可以更换管线；
（4）滤头堵塞、填料脱落——维修或更换色谱柱；
（5）柱子被污染——使用强洗脱能力的溶剂如乙腈、甲醇等清洗色谱柱；
（6）体积过载、质量过载——一般离子型化合物与体积过载时容易产生宽峰，此时可在流动相中加入三氟乙酸(TFA)。质量过载时峰呈现三角状，可适当降低进样浓度或体积；
图1 样品质量过载
图2 降低进样量后样品峰正常
（7）溶剂效应——样品溶剂与流动相洗脱能力相差大，可更换样品溶剂
**酸性条件下,三乙胺率先占据固定相中的高能位点，屏蔽碱性化合物与固定相的吸附作用，从而改善峰形。但当遇到碱性比三乙胺更强的碱性化合物时，其作用就不明显了
1.3 前沿峰
（1）色谱柱过载——样品进样量大，可以降低进样量或降低样品的浓度；
（2）流动相pH不恰当——调整pH
（3）柱温低
（4）色谱柱损坏
1.4 负峰/倒峰
（1）流动相吸附底值过高——适当改变波长；
（2）进样时进入了空气——排气；
（3）溶剂效应——样品溶剂与流动相洗脱能力相差大，可更换样品溶剂；
（4）样品折射率小——示差检测器的信号是折射率，当组分折射率小于流动相时即出现倒峰，可改变流动相添加剂或改变检测波长；
（5）参比波长设置不合适——在二极管阵列检测器中，设置的参比波长有紫外吸收，从而导致色谱峰峰高降低甚至出现倒峰，可通过关闭参比波长来解决
1.5 肩峰/双峰
（1）样品不纯——此时只有少部分的色谱峰为肩峰，其他的色谱峰为正常的色谱峰。改变流动相或色谱柱，选择合适的分离条件；
（2）化合物含有特殊结构——其在特殊条件下存在动态平衡，此时可使用碱性流动相或用特殊方法解决，如衍生化；
（3）色谱柱损坏——若进标准液后仍然产生肩峰，可以判断是色谱柱损坏
1.6 鬼峰
（1）检测器进气泡——平衡时基线规律地产生波动，有可能是检测器进气泡了，此时可以卸下色谱柱，用甲醇/乙腈清洗系统；
（2）上一个样品遗留的组分影响——此时的鬼峰往往保留时间不同，可用大比例有机相冲洗5~10min
2 保留异常
2.1 保留时间短
（1）可更换色谱柱。未被键合的硅羟基和化合物中的极性基团产生氢键或发生离子交换作用，使极性化合物保留增强；
（2）加入离子对试剂。但是离子对试剂对于色谱柱的损伤较大，难以冲洗干净，且易堵塞机器
2.2 目标峰不保留
（1）化合物极性弱——这是比较常见的原因，而此时使用水/甲醇或水/乙腈体系不太容易洗脱下来。可以选择在不流动相中加入少量的异丙醇，增强流动相的洗脱能力。
3 基线异常
实验过程中遇到的基线问题一般是基线噪音高、基线漂移与基线波动，大多都是由于仪器的问题造成的。
3.1 基线噪音过高
（1）氘灯老化——氘灯的使用时间有500、1000、2000h等，超过使用时间后可能出现基线噪音高的问题，此时应更换氘灯；
（2）检测器流通池被污染——卸下色谱柱，用水或甲醇冲洗流通池；
（3）参数设置——有些仪器可以修改灵敏度，灵敏度越大，响应越高，基线噪音也就越大
3.2 基线漂移
（1）平衡不充分——初次使用色谱柱时至少要用10 ~20 倍柱体积平衡色谱柱。若流动相中含有离子对试剂或者使用HILIC模式的色谱柱应采用50~100 倍柱体积平衡体系。示差检测器平衡较慢，参比池和样品池至少需要用流动相平衡2h以上。若波长过低也需延长平衡时间；
（2）梯度洗脱酸度不平衡——在梯度洗脱时，随着有机相的增加，流动相的酸度降低，使基线漂移，可以在有机相中也加入同比例的酸；
（3）氘灯老化——更换氘灯；
（4）检测器流通池被污染——卸下色谱柱，用水或甲醇冲洗流通池
3.3 基线波动
（1）流动相有气泡——停泵，重新超声流动相，延长排气时间；
（2）流通池进气泡——若基线和压力规律波动，一般怀疑是流通池内进了气泡。若为示差检测器，可以提高废液瓶摆放位置，增加背压，减少气泡产生几率；
（3）单向阀堵塞——若泵长时间走纯乙腈或者高比例乙腈，单向阀容易堵塞，此时可以拆卸单向阀进行超声清洗；
（4）流动相混合不均——流动相通过比例阀进行液体的混合，可以采用单泵预混的方式减少基线波动；
（5）检测器流通池被污染——卸下色谱柱，用水或甲醇冲洗流通池
本次推文对HPLC常见色谱异常及其原因的进行了多方面的分析，并提出相应的解决方法，为液相实验的操作提供一定的参考及依据。
参考文献：
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