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氨基酸方法学验证
发布时间：
2020-04-22
导读
氨基酸(amino acid)是含有氨基和羧基的一类有机化合物的通称。生物功能大分子蛋白质的基本组成单位，是构成动物营养所需蛋白质的基本物质。
目前氨基酸的测定通常采用的是离子交换柱后茚三酮衍生色谱法，该方法使用的氨基酸自动分析仪价格昂贵，专属性强，只能分析氨基酸，且分析速度慢。而采用高效液相色谱法测定氨基酸，具有价格便宜，分析速度快、灵敏度高等优点。
方法
衍生化方法
精密称取各氨基酸20mg，加水溶解并稀释至100ml作为供试品溶液。
精密量取供试品溶液2ml，分别置10ml量瓶中，加入1mol/L三乙胺乙腈溶液1ml，0.1mol/L异硫氰酸苯酯(PITC)乙腈溶液1ml，混匀，摇床振摇1小时，加入正己烷4ml，振摇后静置10分钟，取下层溶液，用0.45μm滤器过滤，取滤液2μl进样分析。
溶液配制：
(1)1mol/L三乙胺乙腈溶液：取三乙胺14ml，加乙腈86ml，混匀。
(2)0.1mol/L异硫氰酸苯酯(PITC)乙腈溶液：取PITC 6ml，加乙腈44ml，混匀。
色谱条件
测定方法：外标法
仪 器： Agilent1200 美国安捷伦
色谱柱： 中谱红RD-C18柱
规 格：250×4.6mm 5μm
流动相A：0.1mol/L醋酸钠(冰醋酸调pH至6.5)：乙腈=93：7
流动相B：80%乙腈溶液
按下表进行梯度洗脱：
流 速：1.5ml/min
注：如使用4.6*150短柱规格进行做样，可按下表进行洗脱
柱 温：40℃
检测波长：254nm
注：水为纯化水，甲醇、乙腈为色谱纯，其他的试剂为分析纯。
图谱
丙氨酸单标：
脯氨酸单标：
赖氨酸单标：
混合进样：
结语
由于氨基酸种类较多，结构相近，大部分没有紫外或荧光响应，为提高分析检测灵敏度和分离选择性，将氨基酸衍生化，接上发光或发色基团，再进行定性定量分析，此种方法称为衍生化间接分析法。柱前衍生化是指样品组分经特定化学反应，转变为发光或发色衍生物，再进行色谱分离测定。该法有以下优点：通常不考虑衍生化反应动力学，直到衍生反应完全;为使衍生反应及衍生产率获得最佳效果，可任意选定衍生化条件柱前衍生化反应的溶剂不必与分离时流动相相匹配;衍生化副产物可进行预处理以降低或消除其干扰。
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